Развитие Т-лимфоцитов происходит в центральном органе иммунитета - вилочковой железе (Ф. Бернет, 1971). Среди тимоцитов выделяют три самостоятельные популяции: Т-хелперы (помощники), Т-супрессоры (подавители) и Т-эффекторы. Четвертый тип тимоцитов - киллеров (убийц) накапливается под влиянием антигенной стимуляции Т-эффекторов и завершает тем самым иммунные реакции клеточного типа. Особое значение в настоящее время придается взаимоотношению Т-хелперов и Т-супрессоров, которые обладают способностью тормозить и останавливать антителопродукцию, обеспечивая иммунологическую толерантность (Л. Н. Фонталин, Л. А. Певницкий, 1978, и др.).
Для определения функциональной активности Т-системы применяются следующие методы: подсчет циркулирующих Т-лимфоцитов, реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), реакция ингибиции миграции лимфоцитов (РИМЛ), спонтанное розеткообразование клеток (Е РОК), чувствительность лимфоцитов к кортизолу, цитотоксические тесты при использовании антисывороток к Т-лимфоцитам, определение функциональной активности Т-супрессоров и др. (А. Н. Чередеев, 1976, и др.). Наиболее информативными методами являются РБТЛ и Е-РОК.
Метод РБТЛ основан на том, что Т-лимфоциты в питательной среде под влиянием стимулятора фотогемагглютинина (ФГА) могут превращаться (трансформироваться) в недифференцированные зародышевые клетки (бласты). Допускается, что это происходит за счет освобождения лизосомальных ферментов и разрушения РНК- Чем интереснее происходит превращение лимфоцитов в бласты, тем активнее и полноценнее Т-система (О. И. Епифанова с соавт., 1977).
Существует два метода определения РБТЛ : морфологический и изотопный. Наиболее перспективным методом является изотопный, основанный на определении блаеттрансформацин по включению меченого тимидина (Из) в ДНК лимфоцитов (И. Н. Брауде, 1969; П. Г. Назаров, В. И. Пуринь, 1975, и др). Результаты выражаются в индексах стимуляции.
По данным С. К. Евтушенко (1980), у доноров норма РБТЛ с ФГА составила 61,71 ±9,72 (размах индекса стимуляции после 72 ч инкубации составил от 18,36 до 231,24), что близко к данным литературы (А И. Евсеева с соавт., 1976). Для оценки спецификой сенсибилизации противомозговыми антителами Т-лимфоцитов вместо ФГА в инкубируемую смесь мы добавляли по 1 капле водно-солевого экстракта мозгового антигена (МАГ), приготовленного из различных участков мозга, предварительно определив его митогенпую активность (то есть находили минимальное количество антигена, которое вызывало бластн>ю трансформацию лимфоцитов). Параллельно проводится контроль без ФГА, МАГ и других антигенов.
Реакция спонтанного розеткообразования Т-клеток основана на образовании розеток из Т-лимфоцитов и эритроцитов барана (Е-РОК), которые являются индикаторами (маркерами) Т-лимфоцитов (М Jondal с соавт., 1972). В ограниченном препарате среди всех типов лейкоцитов подсчитывается процент розеткообразующих лимфоцитов. Норма Е-РОК, по нашим данным, составила (51,0+9,7)%, что также близко к данным литературы (С. И. Донское с соавт., 1975, и др.).
Низкий процент розеткообразования лимфоцитов говорит о пониженной активности Т-лимфоцитов, а если он резко снижен, то это указывает на иммунодефицитное состояние (R. Hong, 1977, и др.), требующее соответствующей иммуностимулирующей коррекции.
Проводятся попытки классифицировать поражения нервной системы при аллергии (С. И. Каплаи, 1967; Я. В. Медведев, 1968; W. Wilson, 1967, и др.). В частности, F. Speer (1967) предлагает многообразие всех клинических форм этой патологии объединить в общее понятие «нейроаллергия». Ряд авторов рассматривают нарушения нервной системы при аллергии как часть общего аллергического процесса (Н. К. Боголепов, С. И. Каплан, 1971; Б. С. Агте, С. К. Евтушенко, 1974; J. Blamantier, S. Denimal, 1966, и др.).
Наши последующие исследования (Б. С. Агте, С. К. Евтушенко, 1976, 1980) также подтверждают эти выводы, в связи с чем неврологические проявления аллергии в клинической практике мы условно называем нейроаллергопатией.
Развитие
HR
-бренда через оценку персонала в компании М8,
или Как развиваться с удовольствием
Итак, мы подошли к финальному этапу оценки персонала в корпорации М8. Напомню, оценку проводили полностью автоматизированно: с программистами компании специально разрабатывали интерфейс для оценивания и презентации результатов.
Оценка сотрудников складывалась из оценок качественных параметров (соответствия поведения сотрудника стандартам поведения в компании) и количественных (показателей деловых качеств и профессиональных знаний).
Разработка инструментария для оценки 360°
Соответствие сотрудника стандартам поведения в компании оценивалось методом 360°. Правильнее будет назвать его методом 270°, т.к. оценка сотрудников клиентами не проводилась. Мы не стали менять формат оценки, но изменили содержание, сделав акцент на валидности и минимизации субъективизма в оценках. Для каждого оцениваемого качества (корпоративности, ориентации на команду, лидерства, клиентоориентированности, ориентации на достижения, стрессоустойчивости, неконфликтности и мотивации на работу) была проведена процедура концептуализации и операционализации.
1.
Были уточнены ожидания руководства от своих сотрудников.
2.
Были прописаны конкретные поведенческие примеры проявления каждого качества, соответствующие содержанию труда сотрудников в компании.
Теперь оценка сотрудника по каждому качеству заключается в выборе одного из пяти поведенческих примеров, который в большей степени соответствуют его поведению. Поведенческие примеры сформулированы таким образом, чтобы исключить однозначно негативные характеристики. Каждому примеру присвоен балл (скрыт для оценщика). При новой оценке поведенческие примеры для каждого качества перемешиваются в программе, и у оценщиков нет возможности автоматически выбирать «самые низкие» или «самые высокие» оценки, т.к. характеристики выводятся в списке не по порядку.
На фото: переговорная комната Корпорации М8
Пример (оценка ориентации на команду)
Инструкция
: Выберите из предложенных вариантов только один пункт, лучше других характеризующий человека, которого вы сейчас оцениваете.
Варианты характеристик
:
1.
Предпочитает самостоятельно выполнять работу. Если работа не в полной мере получается, то за консультациями обращается только к руководству. Не ориентирован на помощь коллегам, к нему редко обращаются за советом. Предпочитает не обсуждать свои решения с коллегами.
2.
Обсуждает с коллегами только те свои решения, которые их непосредственно касаются. Может помочь в рабочих вопросах, если к нему обратиться, но делает это с неохотой.
3.
Выполняя поставленные задачи, ориентируется не только на свои потребности, но также учитывает и потребности коллег. В принятии решений учитывает мнение коллег. Готов помочь советом сотруднику, если это связано с выполнением его профессиональных целей.
4.
Готов помочь, когда коллеги обращаются за помощью, даже если это не связано с его профессиональными целями. Готов обсуждать свои решения с сотрудниками и менять решения в пользу интересов команды.
5.
Не только отзывается на просьбы коллег, но и сам предлагает свою помощь, когда видит затруднение сотрудника. В принятии решений ориентирован на мнение коллег, при возникновении спорных ситуаций организовывает обсуждение и старается достичь взаимопонимания.
Такое прописывание каждого варианта сделало процесс оценки одновременно легче и тяжелее для оценщиков. С одной стороны, больше нет необходимости субъективно выбирать баллы и сомневаться по поводу того, что поставил кому-то «двойку» или, напротив, всем поставил «пятерки». Теперь выбрать вариант ответа просто, необходимо всего лишь сопоставить его с реальным поведением сотрудника, которого нужно оценить. С другой стороны, чтение подробных характеристик вначале займет чуть больше времени. Но мы пошли на это осознанно — в целях улучшения качества и правдивости оценки.
На фото: Профессионально оформленная доска почета в Корпорации М8.
Разработка инструментария для профессиональной оценки
Профессиональная оценка проводилась для всех подразделений компании и включала тесты и задачи по профессиональным знаниям сотрудников, знанию процессов в компании, а также количественные результаты продаж и оценку качества продаж для продавцов. Разработка профессиональных тестов, адекватных реально осуществляемым функциям в компании, оказалась довольно трудоемким процессом. И он обошел нас стороной. Руководство поручило разработку профессиональных тестов руководителям подразделений. Был выбран единый формат тестовых заданий, все разработанные тесты подвергались двойной проверке руководства на соответствие заданий требованиям и желаемому уровню сложности.
Мы подключились на этапе апробации профессиональных тестов, анализа понятности и однозначности тестовых формулировок для персонала.
Для того чтобы сделать профессиональную оценку более гибкой, программисты создали такую оболочку для прохождения профессиональных тестов, которая позволяла не только выбирать правильный ответ из нескольких вариантов, но и самостоятельно писать ответы на открытые вопросы. Ответы на подобные вопросы оценивали эксперты (ими являются руководители, ответственные за тот или иной тест). Чтобы избежать предвзятости оценщиков, имена ответивших на вопросы остаются скрытыми до того момента, пока эксперт не оценит правильность ответа. Только после этого результаты становятся видны и самому сотруднику, и его оценщику.
При предъявлении результатов профессиональной оценки мы снова сделали акцент на обязательной обратной связи: все ошибки и неточности, допущенные при прохождении тестов, выводятся в результатах сотруднику. Важно, что оценка направлена на то, чтобы сотрудники развивались, в т.ч. обучаясь на своих ошибках.
На фото: Отличительный знак "Лучшему фрезеровщику" Корпорации М8
Разработка инструментария для оценки качества продаж: «Тайный покупатель»
Эта оценка стала составной частью профессиональной оценки продавцов. Мы провели ее методом «Тайный покупатель». Обычно, организуя такую оценку, мы стараемся выбирать наиболее экологичные способы проверки, стараясь не причинять необоснованного дискомфорта сотрудникам компаний заказчиков. Организовать инсценировку телефонных и очных продаж можно, используя хорошо подготовленных и артистичных агентов-покупателей, но такая оценка часто бывает излишней и по затратам на подготовку не всегда окупает получаемый результат. Для компании М8 было решено применить другой способ.
Чтобы понять, как мы организовали «Тайного покупателя» в М8, нужно кое-что знать о компании. Все разговоры со стационарных телефонов компании записываются. Все записи хранятся в системе. Все сотрудники имеют доступ к этим записям. И никого из них особо не интересует возможность прослушать товарища. Культура общения в компании открытая. Поэтому вариант, который мы выбрали, отлично подошел к культуре М8.
Для начала с ключевыми сотрудниками компании, ответственными за подготовку продавцов, был разработан чек-лист с контрольными точками проверки разговоров. Было решено проверять 3 типа разговоров: звонки новых клиентов, звонки постоянных клиентов и звонки недовольных клиентов (от последнего варианта пришлось отказаться, поскольку таких звонков в базе оказалось мало и оценки по ним были невалидными).
Мы подготовили специалиста для оценивания звонков по чек-листу, прояснили спорные моменты и нюансы продаж. На каждый тип звонка наш специалист выбирала по 3 звонка в базе и по ним ставила отметки в чек-листе.
Важно упомянуть, что даже чек-лист для оценки телефонных продаж был автоматизирован программистами компании. Для нашего специалиста оборудовали рабочее место с доступом к базе данных звонков и интерфейсом для внесения отметок. Все отметки автоматически суммировались программой, добавлялись в общую количественную оценку и вместе с комментариями выводились на страничках результатов сотрудников.
Таким образом, у сотрудников появилась возможность не только посмотреть итоговый результат, но и прочитать комментарии, увидеть чек-листы со своими отметками и самостоятельно прослушать звонки, чтобы понять неточности в своей работе с клиентами.
На фото. Рабочее место для оценки телефонных продаж. На мониторе виден интерфейс для внесения отметок оценщиком и большая кружка с кофе — неотъемлемый инструмент любого наблюдателя.
Социометрическая оценка коллектива (внедрение планируется позже)
По мере разработки интерфейса оценки мы решили добавить социометрическую оценку (анализ микрогрупп и общения сотрудников в коллективе). Для этого при оценке каждого сотрудника около его фотографии появляется 2 вопроса:
1. Если бы вам поручили самостоятельно выбрать в свою команду пять сотрудников из компании, вы бы выбрали этого человека?
2. Если бы у вас была возможность поехать в путешествие с пятью сотрудниками компании, вы бы выбрали этого человека?
Под каждым вопросом появляется примечание-подсказка на случай неверного понимания
инструкции или желания изменить свой ответ: Вы уже выбрали 5 человек: П. Петрова, И. Иванова, В. Сидорова, И. Круга, О. Рубинштейна. Желаете изменить свой выбор?
В таком виде социометрия представляет собой упрощенный вариант с малым кругом выбора относительно большого коллектива, но требование «необходимости и достаточности» в этом случае было очень важным. Главной задачей было узнать максимум информации о сотрудниках, но при этом не перегрузить их лишней активностью. Поэтому социометрия использовалась нами ориентировочно для постановки гипотез директору и HR -менеджеру компании.
Далее в систему достаточно ввести формулы подсчета и графического отображения, и она сама проанализирует результаты оценки, выведет коэффициент групповой сплоченности, а также графически представит группы сотрудников, тесно общающихся друг с другом.
Апробация и валидизация инструментария
Перед запуском оценки мы провели обязательную процедуру апробации. Для этого мы пригласили нескольких сотрудников разных подразделений компании и устроили «пилотажное тестирование». Сотрудникам намеренно давался минимум инструкций по использованию системы, чтобы можно было отследить типичные трудности и ошибки. Когда апробация была закончена, мы подготовили краткую инструкцию по использованию системы, включающую ответы на типичные затруднения.
На фото: апробация системы с ключевыми сотрудниками Корпорации М8.
Валидизацию (т.е. проверку на адекватность методов тому, что они призваны измерять) мы проводили в несколько этапов. Первым этапом валидизации было подтверждение конструктной валидности (соотнесение оценочных формулировок с определением понятий, которые они должны были измерять), затем характеристики и профессиональные тесты подверглись проверке экспертов из руководства компании. Финальным этапом стала пилотная оценка и проясняющие интервью с отдельными сотрудниками компании: после ответов на вопросы сотрудники поясняли свой ответ и давали характеристику оцениваемому сотруднику, приводя примеры и сопоставляя свое мнение с получившейся в итоге оценкой. Эта проверка позволяла удостовериться в том, что в сокращенном варианте созданные шкалы измеряют то же самое, что оценщик может рассказать о сослуживце подробно (и, в идеале, что на самом деле о нем думает).
Ретестовую проверку на валидность (оценку одного и того же качества разными методиками) в этот раз было решено не применять, т.к. оцениваемые личностные качества сотрудников формулировались в системе ценностей и категориях корпоративной культуры, что делало их довольно уникальными и сложно поддающимися проверке другими, внешними по отношению к культуре инструментами.
На фото: красивые коридоры Корпорации М8
Представление результатов оценки
При представлении результатов оценки основной упор был сделан на визуализации, обязательной обратной связи и рекомендациях, направленных на развитие.
Визуализация.
Каждая количественная оценка выражается графически — на осях координат откладываются оценки по каждому качеству, в результате чего выстраивается профиль сотрудника.
Нам было важно донести до сотрудников и их руководителей понимание того, что отметки в оценке могут быть ситуативными, отражать не самый удачный период в профессиональной жизни специалиста и не свидетельствуют напрямую о его личностных качествах. Поэтому все результаты, даже для очень низких оценок, формулировались нами в позитивном ключе, с горизонтами развития сотрудника. При оценке 360° к результатам обязательно добавлялись рекомендации. Для каждого качества было прописано по 3 уровня расшифровок и индивидуальных рекомендаций (для оценок ниже среднего, средних и выше среднего).
Пример
расшифровки результатов оценки 360° для низких оценок по качеству «стремление к достижениям».
Ваш результат
: 26 % — это ниже средней оценки в компании. Это значит, что в вашей повседневной работе коллеги не замечают у вас стремления к достижениям, покорению новых вершин. Похоже, иногда вы можете оставить работу недоделанной и остановиться на половине пути в достижении своей цели.
Обратите внимание на это свое качество, т.к. настойчивость и следование амбициозным целям — это те качества, которые отличают успешных людей. Возможно, вам иногда не стоит тревожиться о том, что что-то может не получиться, а стоит просто делать первый шаг и постоянно поднимать перед собой планку. Наша компания настолько быстро развивается, что в ней неприемлемо отношение к работе как к вахте «от звонка и до звонка». Это просто не в нашей культуре. Мы хотим идти вперед и постоянно завоевывать новые вершины. Компания ждет от вас более амбициозных целей и большей настойчивости в их достижении. Лучше несколько раз споткнуться, но дойти до вершины, чем бросить начатое на половине пути.
Рекомендации
: попробуйте пересмотреть свое отношение к рабочим обязанностям и личным целям. Возможно, вы не слишком требовательно относитесь к своим планам, либо, наоборот, слишком строги к себе, от чего нередко просто не можете решиться на сложную задачу из страха, что не получится выполнить ее хорошо. Настойчивость и ориентация на обязательное достижение результата — эти качества вам необходимо развивать, чтобы быть успешным в профессиональном и в личном плане.
В развитии стремления к достижениям и настойчивости в достижении целей вам помогут следующие книги…
На фото: Интерьер рабочей зоны в Корпорации М8
Интерфейс оценки
Интерфейс оценки представлен вкладками: «Оценить сотрудников», «Результаты количественной оценки» и «Результаты качественной оценки», «Пройти профессиональное тестирование».
Вкладка «Оценить сотрудников»
1.
Каждый участник может сам выбирать для оценки сотрудников из структуры компании (система напоминает, сколько человек осталось оценить и какой процент работы выполнен
).
2.
При выборе сотрудника для оценки на страницу подгружается фото и информация о нем.
3.
При оценке сотрудника можно не только ответить на вопросы о нем, но и написать ему личное пожелание, которое отразится в карточке его результатов.
Вкладки «Результаты количественной оценки» и «Результаты качественной оценки»
Эти вкладки — самые важные, т.к. представляют все личные результаты оценки сотрудника.
1.
На осях компетенций откладываются одновременно оценки от каждого уровня: руководства, коллег, подчиненных и самооценка сотрудника. Это позволяет сравнивать восприятие себя разными людьми в компании и корректировать поведение с ними.
2.
Начиная со следующей оценки, свои результаты можно будет посмотреть в динамике на специальном графике, что наиболее наглядно будет показывать сотрудникам их развитие.
3.
По результатам оценки выстраивается интегральный численный показатель, который отражает условное место каждого сотрудника в итоговом рейтинге оценки в компании. Начиная со следующего периода оценки, сотрудники смогут видеть динамику этих показателей.
4.
В этой вкладке отражаются также результаты профессионального тестирования и проверки методом «Тайный покупатель», выраженные в итоговом балле. При желании сотрудник может развернуть результаты и посмотреть список всех своих неверных ответов или действий.
5.
Уровни для итоговой оценки ниже среднего, средний и выше среднего будут рассчитываться специально по результатам в компании на основе внутреннего распределения оценок. Это позволит отталкиваться при распределении сотрудников по группам не от идеальных чисел, а от реальных оценок.
Традиционно считается, что Т-34-это первый в мире массовый средний танк с рациональными углами наклона броневых листов корпуса и башни, дизельным двигателем и длинноствольной 76-мм пушкой. Все это верно, как верно и то, что по своим ТТХ «тридцатьчетверку» на 1941 год можно признать сильнейшим средним танком в мире. Однако нельзя забывать, что танк, как, впрочем, и любой другой вид боевой техники, создается для боя, и очень важно, насколько его конструкция позволяет реализовать даже самые высокие заявленные характеристики, поскольку многие, на первый взгляд, удачные конструктивные решения на деле могут обернуться недостатками.
Т-34 был скомпонован по классической схеме с кормовым расположением двигателя и трансмиссии. Форма его корпуса и башни была признана и противниками, и союзниками наиболее удачной для своего времени сточки зрения снарядостойкости и считалась образцом для подражания. Но чудес не бывает, и за все приходится платить. В данном случае - забронированным объемом. Выгодный, с точки зрения снарядостойкости, большой наклон лобовой брони вкупе с неудачным, хотя и конструктивно более простым - продольным - расположением массивного 12-цилиндрового двигателя, сократил объем боевого отделения и не позволил разместить люк механика-водите-ля на подбашенном листе корпуса. В результате люк выполнялся в лобовом листе, что существенно снижало его снарядостоикость.
Обтекаемая, красивая внешне, даже элегантная башня «тридцатьчетверки» оказалась слишком мала для размещения артсис-темы 76-мм калибра. Доставшаяся по наследству от легкого А-20, она изначально предназначалась для установки 45-мм пушки. Таким же, как у А-20, остался и диаметр башенного погона в свету - 1420 мм, всего на 100 мм больше, чем у БТ-7.
Ограниченный объем башни не позволил разместить в ней третьего члена экипажа, и наводчик орудия совмещал свои обязанности с обязанностями командира танка, а порой и командира подразделения. Приходилось выбирать: или вести огонь, или руководить боем. Этот недостаток отмечался офицерами НИБТПолигона в 1940 году, а затем немцами и американцами. Последние, например, вообще никак не могли понять, каким образом наши танкисты могут помещаться в башне зимой, когда носят полушубки.
Теснота башни и боевого отделения в целом существенно уменьшали все достоинства мощной 76-мм пушки, обслуживать которую было просто неудобно. Крайне неудачно, в вертикальных кассетах-чемоданах размещался боекомплект, что затрудняло доступ к снарядам и снижало скорострельность.
Вентиляция танка осуществлялась вентиляторами системы охлаждения и дополнительным вытяжным, расположенным в перегородке моторного отделения. В крыше башни имелось вентиляционное отверстие, но принудительной вентиляции не было! В отчете НИБТПолигона указывалось, что «содержание СО при выстреле даже с работающей вентиляцией значительно превышает допустимую норму (0,1 мг/л) и является токсической».
В 1940 году был отмечен и такой существенный недостаток танка, как неудачное размещение приборов наблюдения и их низкое качество. Так, например, смотровой прибор «кругового обзора» устанавливался справа сзади от командира танка в крышке башенного люка. Доступ к прибору был крайне затруднен, а наблюдение возможно в ограниченном секторе: обзор по горизонту вправо до 120°; мертвое пространство 15 м. Ограниченный сектор обзора, полная невозможность наблюдения в остальном секторе, а также неудобное положение головы при наблюдении делали смотровой прибор совершенно непригодным к работе. Неудобно располагались и приборы наблюдения в бортах башни. В бою все это приводило к потере зрительной связи между машинами и несвоевременному обнаружению противника. Органическим недостатком Т-34 являлась пружинная подвеска типа Кристи, сообщавшая машине во время движения сильные колебания. Кроме того, шахты подвески «съедали» значительную часть забронированного объема.
Важным и неоспоримым достоинством танка было применение мощного и экономичного дизельного двигателя. Но двигатель в танке работает в крайне перенапряженном режиме, в частности, и сточки зрения воздухоподачи и воздухоочистки. В отчете начальника 2-го управления Главразведуп-равления Красной Армии генерал-майора танковых войск Хлопова, составленном по результатам испытаний танка на Абердинс-ком полигоне в США, говорилось: «Недостатки нашего дизеля - преступно плохой воздухоочиститель на танке Т-34. Американцы считают, что только саботажник мог сконструировать подобное устройство. Для них непонятно также, почему в нашем наставлении его называют масляным. Испытания в лаборатории и испытания его в поле показали, что воздухоочиститель вообще не очищает воздух, попадающий в мотор; пропускная способность его не обеспечивает приток необходимого количества воздуха даже при работе мотора вхолостую.
В результате этого мотор не развивает полной мощности - и попадающая в цилиндры пыль ведет к очень быстрому срабатыванию их, падает компрессия, и мотор теряет еще больше мощности. Средний танк Т-34, после пробега в 343 км, окончательно вышел из строя и не может быть отремонтирован. Причина: вследствие чрезвычайно плохого воздухоочистителя на дизеле в мотор набилось очень много грязи и произошла авария, в результате которой поршни и цилиндры разрушились до такой степени, что их невозможно отремонтировать».
Вот так: 300 с небольшим километров пробега - и двигателя нет, и все из-за убийственно плохой конструкции воздухоочистителя «Помон»!
Впрочем, самой большой проблемой «тридцатьчетверки», и это подтверждается и немецкими, и американскими документами, стала трансмиссия, и в первую очередь крайне неудачная конструкция коробки передач. Вот что по этому поводу писали немцы: «Подавляющее большинство КПП в танках наших противников (имеются в виду Т-34 и KB - Прим.авт.) плохо переключается, отчасти оттого, что в большинстве случаев это - простая система передвигаемых шестерен; кроме того, заднее расположение двигателя и КПП в танках делает необходимыми длинные рычаги управления передачами, имеющими большой мертвый ход, вследствие наличия промежуточных звеньев, что вызывает при быстрых переменах скоростей неправильные переключения. В плохом переключении заключается самая большая слабость советского танка Т-34. Следствием этого является сильный износ сцепления. Почти все захваченные нами танки при сохранности всех остальных частей вышли из строя из-за повреждения сцепления»
Из-за быстрого износа, а также вследствие неудачной конструкции главный фрикцион почти никогда не выключался полностью, его «вело» и переключить передачу в таких условиях было делом сложным. При невыключенном главном фрикционе «воткнуть» нужную передачу удавалось только очень опытным механикам-водителям. Остальные же поступали проще: перед атакой включалась 2-я передача (стартовая для Т-34), а с двигателя снимался ограничитель оборотов. В движении дизель раскручивали до 2300 об/мин, танкже соответственно разгонялся до 20 - 25 км/ч. Изменение скорости осуществлялось изменением числа оборотов, а попросту - сбросом «газа». Нет необходимости объяснять, что такая солдатская хитрость уменьшала и без того небольшой моторесурс двигателя. Впрочем, редкий танк доживал до выработки его «сердцем» даже половины этого ресурса.
Нельзя признать удачным и побортное расположение топливных баков, да еще в боевом отделении и без выгородок. Не от хорошей жизни танкисты стремились перед боем заполнить баки до отказа - пары солярки взрываются не хуже бензиновых, сама солярка - никогда.
Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что в 1941 году основными недостатками танка Т-34 были теснота боевого отделения, плохая оптика и неработоспособные или почти неработоспособные двигатель и трансмиссия. Судя по огромным потерям и большому количеству брошенных танков, недостатки Т-34 в 1941 году взяли верх над его достоинствами.
Читатель, наверное, уже обратил внимание, что многих этих недостатков можно было бы избежать, если бы в серию был запущен танк Т-34М с трехместной просторной башней с большим диаметром погона, полученным за счет вертикального, а не наклонного, как у Т-34, расположения бортов, пятискоростной коробкой передач, торсионной подвеской и т.д. Однако этого не произошло. Более того, Т-34М, судя по всему, сыграл в судьбе Т-34 роковую роль. Сотрудники КБ завода № 183, увлекшись проектированием новой машины, совсем упустили из виду работу по устранению конструктивных недостатков у серийных «тридцатьчетверок» и опомнились только в начале 1942 года.
Следует подчеркнуть, что Т-34 1941 года выпуска - это не Т-34 1942-го и, тем более, 1943 года. Проблемы с двигателем и трансмиссией были сняты установкой двух воздухоочистителей типа «Циклон», пятискоростной коробки передач с постоянным зацеплением шестерен и усовершенствованием конструкции главного фрикциона. В результате маневренные характеристики танка резко возросли.
Обзорность из танка удалось несколько улучшить за счет применения призматических приборов наблюдения вместо зеркальных и введения нового прицела ТМФД-7. Вертикальные кассеты для снарядов заменили на горизонтальные ящики, обеспечив доступ сразу к нескольким выстрелам. В башне был установлен вытяжной вентилятор.
К сожалению, в полной мере не удалось решить вопрос тесноты боевого отделения. Не очень помогло и внедрение в 1942 году новой башни. Уменьшив наклон ее стенок, удалось добиться несколько большего внутреннего размера по ширине, но башенный погон остался прежним, и разместить в башне третьего танкиста было нельзя. По этой причине не вызвало должного эффекта введение в 1943 году командирской башенки, поскольку командир танка по-прежнему не мог одновременно вести огонь из пушки и пользоваться командирской башенкой. На поле боя она оказывалась бесполезной.
Маленький диаметр башенного погона не позволил разместить в башне Т-34 пушку более крупного калибра. Создалась парадоксальная ситуация: если в начале войны Т-34 зачастую не мог реализовать свое превосходство над немецкими танками в броневой защите, мощи вооружения и подвижности по причине конструктивных недостатков, то появление на поле боя «тигров» и «пантер» практически свело на нет всю работу по их устранению. На повестку дня встал вопрос о более солидной модернизации.
Вместе с тем необходимо отметить, что танк Т-34, изначально довольно сложный по конструкции, в процессе серийного выпуска максимально приспособили к существовавшим у нас в годы войны условиям производства, для которого были характерны привлечение к выпуску боевых машин неспециализированных предприятий и широкое использование малоквалифицированных рабочих кадров. В связи с этим осуществлялась плановая работа по уменьшению номенклатуры деталей и снижению трудоемкости. Так, на 1 января 1941 года вся трудоемкостьТ-34 с корпусными деталями и башней составляла 9465 нормо-часов, а на 1 января 1945 года -3230. В итоге конструкция танка была предельно упрощена, он отличался высокой ремонтно-пригодностью, позволявшей в массовом порядке осуществлять восстановление подбитых боевых машин и замену вышедших из строя агрегатов. В среднем в годы войны каждый танк Т-34 восстанавливался 3 - 4 раза.
По-видимому, именно здесь и кроется секрет популярности этой боевой машины. Это был русский танк, для русской армии и русской промышленности, максимально приспособленный к нашим условиям производства и эксплуатации. И воевать на нем могли только русские! Он прощал то, чего не прощали, например, при всех их достоинствах, лендлизовские боевые машины. К ним нельзя было подойти с кувалдой и ломом, или вправить какую-нибудь деталь ударом сапога.
Следует учитывать и еще одно обстоятельство. В сознании большинства людей танки Т-34 и Т-34-85 не разделяются. На последнем мы ворвались в Берлин и Прагу, он выпускался и после окончания войны, состоял на вооружении до середины 1970-х годов, поставлялся в десятки стран мира. В большинстве случаев именно Т-34-85 стоит на постаментах. Ореол его славы распространился и на куда менее удачливого предшественника. Но это уже другой танк и другая история...
Относительная длина отделений корпуса (в % от длины корпуса в свету) у средних танков различных стран
|
Марка танка |
Расположение трансмиссии |
Относительная длина отделений, % |
|||
|
управления |
моторное |
трансмиссионное |
|||
|
«Крусейдер» |
кормовое |
||||
|
«Кромвель» |
кормовое |
||||
|
«Комета» |
кормовое |
||||
|
кормовое |
|||||
Диаметр башенного погона у танков с 75- и 76-мм пушками
Р Г Б ОД
Ставропольская государственная сельскохозяйственная академия
На правах рукописи
в;шыяков Геннадий викторобич
ОЦЕНКА Т- и Ъ- СИСТЕМ ИММУНИТЕТА ПРИ ПСОРОПТОЗЕ ОВЕЦ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕР БОРЬШ С НИМ
диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
|>„"авропаль - 1994
Работа выполнена в Ставропольской научно-исследовате.гьской ветеринарной станции /НИВС/, овцеводчес:шх хозяйствах Ставропольского:фая и во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарном энтомологии и драхнсчогии.
Научные руководители: доктор ветеринарах наук, профессор, член-кор.РАС.ХН В.3.Филиппов
доктор ветеринарных наук, профессор А.А.Всдянов
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор А.у Дмитриев
доктор биологических наук, профессор И.М.Ганиев
Ведущая организация - Московская ветеринарная
академия имени К.И.Скрябина
¡Зуцита состоится " £ " 1994 г. в "/О" т:асов
ни заседании специализированного совета К-120.53.01 _ Ставропольской государственной сельскохозяйственной"академии.
Адрес: 355014, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический., 10.
С диссертацией мсжно ознакомиться в библиотеке Ставропольской
государственной сельскохозяйственны! академии.
Ученый секретарь -
специализированного совета кЭО"ЬС^ А.^.Боголюбова
1. ОБ.:!АЯ МРАТГШ1СТИКА РАБОТЫ
Несмотря на проведение широкого ряда мероприятий по ликвидации псороптоза овец в Ставропольском крае, в отдельных районах региона это заболевание продолжает регистрироваться довольно часто. От пер;.болевэн;тя псороптозом каждая овца теряет в среднем 25,5$ ш^сти и 10,952 живой массы /Башкатов Г.А., 1970/.
Литературные данные последних лет так же свидетельствуют, чго в ряде республик, краев и областей нашей страны, псороптоз овец имеет еще значительное распространение /П.С.Страна;!,кин,1983", А.А.Водянов, 1984; Б.В.Авдричук, Л.Ф.Юрицин, 1986; С.Н.Никольский, 1991 и др./. В нодэй стране и за рубежом накоплен огромный фактический материал, связанный с этим заболеванием, разработан ряд мероприятий по борьбе с ним. Однако, потери в овцеводстве от псороптоза продолжают оставаться высокими и складываются из снижения привесов, настрига шерсти и ухудшения ее качества, затрат на проведение мероприятий по ликвидации илвазии, дополнительного расхода кормов на восстановление упитанности овец после" перенесенного заболевания и их отхода /Р.М.Каплан, А.А.Яков--:ев, В.В.Терещенко, 1973/.
В последние десятилетия в борьбе с псороптозом овец применяют главным образом хлор-, фосфорорганические и карбаматные препараты. Многие из них не отвечают современным требованиям ввиду их Рвдостаточной эффективности, высокой токсичности для животных и человека, способности накапливаться и длительно сохраняться во внешней среде, организме животных и, по всей вероятности, они снижают резистентность организма животных. Кроне кого, установлено, что у многих видов членистоногих /клещи,мухи,вши, тараканы, клепы/ наблюдается резистентность ко многим широко применяемым ицгсктоат<арицидам различной химичзской природы /М.А.Палимпсестов, 1959; Е.А.Чалдык,1977б:Б.$1о*г.,197а;
1976;3&.Wcl , 1978; L.P.lavv$tw,f\."P.S\04.w>. . 1980/. Поэтому, одной из важных задач в ветеринарной акарологии язляется изыскание высокоэффективных препаратов против клещей - возбудителей поороптоза овец и менее токсических для теплокровных. Расширение-ассортимента акарицидов.позволит чередовать их.применение» что предотвратит развитие резистентности у клещей.
Немаловажную роль в разработке мер борьбы с псороптозом овец, на наш взгляд, доджно быть отведено изучешз> их иммунного статуса. К сожалению, данных по иммунобиологической реактивности организма животных при этом заболевании мы не нашли в доступней литературе.
1.2. Пель и задачи исследований. Основная цель.работы. - изыскание высокоэффективных средств терапии, профилактики и изучение иммунобиологической реактивности организма овец при псороптозе.
Для выполнения поставленной цели перед нами были поставлены следующие задачи:
Изучить распространение псороптоза овец в Ставропольском крае; г изучить особенности развития иммунитета;
Дать оценку Т- В- системам иммунитета;
Изучить юшетику -Т- и В- лимфоцитов, характер изменений качественных показателей Т- системы на"субпопуляционном уровне, доследовать состояние функциональной активности эозинофилов, макрофагов и нейтрофилои крови у овец;
Изучить терапевтическую и профилактическую эффективность новых акарицвдных препаратов в лабораторных и производственных условиях.
1.3. Научная лоьизна.
Впервые дана оценка Т- и В- системам иммунитета при псороптозе овец и показаны особенности развития иммунитета, обусловленные морфологической характеристикой клещей Tsoi optes ovii
~ Выявлена акарицидная активность новнх препаратов, входящих в группу химически модифицированных соединений биологической природы, известных как "авермектины", и лх пролонгированных форм.
1.4. Практическая ценнооть работы.
Данные.полученные при изучении акарицидной эффективности указанных препаратов, послужили основой их применения в борьбе с псо-рептозом овец и вошли во "Временное наставление со применению био-
логического акарицида саркопцидина для лечения сельскохозяйственных животных и пушных зверей при саркоптоидозах" /утверждено ГУБ МСХ СССР 22.10.90./ и "Временное наставление по применению аверсекта при псороптозе овец ж крупного рогатого скота." /утверждено ГУБ MCI РФ 11.12.92./
Препараты саркопцидин и пролонгированные формы ивомека /клеевая и ИП-1/ рекомендованы для широких производственных испытаний.
Результаты оценки Т- и В- систем иммунитета при пссроптозе овец Moiyv быть использованы для разработки иммунокоррегирувщей терапии и в учебных программах ветеринарных вузов, факультетов и техникумов.
1.5. Апробация ":°зультатов. Материалы диссертации доложены на научной конференции СХИ /Ставрополь, 1993/, Ученых созетах Ставропольской НИВС /Ставрополь, 1991-1993/, на заседаниях Ученого совета ВНИИВЗА /Тюмень, 1991-1993/.
1.7. Объем у структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах м?шноплсного текста. Текст иллюстрирован 29 таблицами, 10 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и списка использованной литературы /198 источников, в том числе 66 зарубежных/.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЬЩОВАНКп
В основу работы положены результаты экспериментов, проведен^ них на 203 экспериментально и спонтанно зараженных накожшковы-"ли клещами овцах разных половозрастных групп. Производственные опыты проведены а? 1515 овцах различных пород.
Изучение распространения псороптоза овец проводили по данным отчетов районных ветеринарных станций к результатам клинического т. акарологичрекого обследования жчеотных в хозяйствах. .
Природно-климатическая, хозяйственная характеристика края и распространение псороптоза описаны на основании систем ведения сельского хозяйства Ставропольского края /А.А.Никонов и др., 1980/ и дайных ветеринарной отчетности.
Иммунобиологическую реактивность овец при экспериментальном
псороптозе изучали на 20 овцах кавказской породы.- Оценку иммунного статуса проводили по следующим методикам:
Оценку Т- системы иммунитета в реакции спонтанного розеткообразо-вания по методу И.Золс1о(.1/198.1/;
Определение теофиллинрезистентных и теофшшш чувствительных Т-ялеток по методу ¿.итаИЬиЛ я1.«1,/1978/ ;
Оценку В- системы иммунитета по методу £.\Леу\<и»,/1973/;
Количество лейкоцитов и лейкоцитарный профиль определяли по общепринятой методике.
Изучение эффективности новых акарицидов при псороптозе овец проводили в лабораторных и производственных условиях в осенне-зимние периоды, используя "Методические указания по первичном? отбору новых.акарицидов и сравнительному изучению их активности против саркоптовдных клещей" /П., ВА.СХНЖ, 1982/.
В чиле изучаемых нами, препаратов были: саркопцидин, клеевая и пролонгированные формы ивомека, ивомек-пурон, аьерсект, лрепараты-ИК-1, ИК-2, ИК-3, ИП-1.И-1, И-2 и й 41. Дозы, методы и кратность* их применения указаны в соответствующих разделах автореферата.
Материалы исследований обработаны по методу Стьвдента /В.Ю. Урбах, 1963/.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Природно-климатическая-и хозяйственная характеристика Ставропольского края
В крае ввделено пять сельскохозяйственных зон,"характеризующихся особенностями климата-, почв, рельефа и структуры земельных угодий, преобладающими типами сельскохозяйственных предприятий, набором возделываемых культур и отраслей: первая - овцеводческая /крайне засушливая/, вторая - зерново-овцеводческая /засушивая/," третья - зерново-скотоводческая /неустойчивого увлажнения/, четвертая - прикурортная зона /достаточного^увлажнения/, пятая зона.- горного скотоводства /избыточного увлажнения/.
Таким образом, для. края характерно многообразие природно-климатических условий от полупустынь на северо-востоке и вечными снегами на юго-западе, которое обуславливает эпизоотическую ситуацию указанных зон по псороптозу овец.
2.2.2. Распространение псороптозе овец в Ставропольском крае
С целью изучения распространения псороптоза овец в 1501-1932 гг было проведено обследование отдельных хозяйств Ставропольского края.
Полученные данные свидетельствуют, что псороптоз ежегодно регистрируется во всех климатических зонах и составляет"от 11 до 25$ общего поголовья; наибольшее распространение болезни отмечается в 3 зоне. В некоторых хозяйствах в отдельные годы пораженность овец накожниковой чесоткой достигала 50?? и более.
Заболевание наносит значительный экономический ущерб овцеводству за счет резкого снижения настрига и качества шерсти, уменьшения живой массы. Распространение псороптоза, как покарали наши исследования, связано с рядом причин, в частности: дефицитом противопсороп-тозных средств, в результате чего не проводится обработка отар, подозреваемых в заражении и не обрабатываются овцы индивидуального сектора; не проводится или проводится некачественно дезакаризация кошар и выгулов; часть овец неблагополучных отар /хурда/, в силу истощения и сопутствующих болезней не подвергается обработке, оставаясь источником инвазии; безнадзорный ввод в общественные отары овец индивидуального пользования, сомнительного по псороптоэу ола-гополучия; не соблюдаются методики обработки овец в Еаннах и регламент использования кусочной эмульсии.
2.2.3. Специфика возбудителя псороптоза овец, определяющая особенности течения иммунологических процессов
В отличие от возбудителей^инфекционных болезней у клещей имеется ряд существенных особенностей в биологии и физиологии. Самым показательным отличием являются большие размеры клещзй со сложной морфологической организацией»
у клещей- пищеварительная и экскреторная системы, продукты выделения которых могут оказывать на организм овец как токсическое, так и антигенное воздействие.
Принципиальные отличия возбудителя псороптоза и инфекционных болезней в типе размножения и физиологии. Клещи развиваются стадий-
но /яйи.о-личинка-прстонимфа-телеоним| а-имаго/ с длительным биологическим циклом и только на кожных покровах» Каждой стадии клеща должен быть присущ и свой антиген. Бактерии, грибки, вирусы и в большинстве простейшие воздействуют на организм хозяина своими корпускулярными антигенами; клещи же могут влиять на него и продуктами своего распада - соматическими антигенами. В большинстве же случаев они воздействуют на организм только своими метаболитами и секретами. Избирательная локализация клещей обусловлена местом, где они находят наиболее благоприятные условия для своего развития и существования.
Выживаемость клещей-накожников /наряду с условиями окружающей среды - температуры, влажности/ в немалой степени зависит от возрастных, физиологических, индивидуальных особенностей организма хозяев, юс иммунобиологической реактивности.
Учитывая изложенное, мы попытались расшифровать механизм иммунитета при псороптозе овец, дав оценку главному из его звеньев -Т- и В- системам иммунитета. . " "
2".2.4. Оценка Т- и В- систем иммунитета
Для изучения иммунобиологической реактивности организма овец прр экспериментальном псороптозе было проведено два опыта. В них участвовало по 10 одногодичных валушков кавказской породы, которых разделили на две группы: подопытную /5 толов/ и контрольную /5голов/. Для исключения.возможного перезаражения животных содержали в отдельных боксах.
Животным первой группы подсаживали по 10 имаго накожниковых клещей с интервалом "в три дня. Овцы второй группы служили контролем. Для определения иммунного статуса брали кровь до заражения, а затем на о, 10, 15, 20, 30,40 дни с начала первой подсадки, и в течение 50 дней за животными вели клинические наблюдения. Опыт первый описан в разделах 2.2.4.1. - 2.2.4.6., опыт второй - 2.2.4.7. - 2.2.4.12
2.2.4.1. Клинические наблюдения
Первые клинические признаки псороптоза отмечали у овец на 10-й день.после первого заражения. В местах подсадки клещей /область плеча/шерсть была спутана, штапель грязный., животные проявляли легкое беспокойство. На 15 сутки: в местах подсадки клещей шерсть спутана, грязная, кивотше. проявляли легкое почесывание; на коже в области плеча мокнущие очаяки с наличием желтоватого Еыпота; температура тела была повышена у всех подопытных овец на 0,8 -1,0°С. На 20 сутки наблюдали выраженный псороптозный процесс: животные прояв-
ляли беспокойство, при исследовании соскобов у всех были■обнаружены клещи о".мз температура тела повышена на 1,0 - 1",1°С.
На 30 день после первой подсадки клещей все животные были больны псороптозом, г. соскобах находили клещей накожников во всех фазах развития. Температура тела была повышена на 0,5 -0,7°С. У контрольных животных отклонений от нормы не "отмечали.
На 40 день животные отказывались от корма, в местах поражения /область плеча/ видны "забои", шерсть спутана, выбита,- животные терлись о твердые предметы, доставали пораженные участки кожи зубами и били задними конечностями. Температура тела 40,0 - 40,7°С. Акаролог.отеское исследование соскобов показало наличие наксжнико-В11х клещей во всех фазах развития.
У контрольных животных в вышеуказанные сроки обследования отклонений в клиническом статусе не отмечали.
2.2.4.2. Кинетика общего количества лейкоцитов
На 5 сутки после заражения овец установлена тендзнция увеличения з крови количества лейкоцитов о 7,5^1,2 до 9,61-0,8 тыс/мкл, на 10 сутки- до 9,11*1,3 тыс/мкл, а на 15 день исследования количество лейкоцитов у подопытных и контрольных животных снизилось до 4,32*0,2 тыс/мкл.
Через 20 дней у подопытных животных количество лейкоцитов увеличило-^ до 8,956*0,5 тыс/мкл, а на 30 сутки - до 9,575*0,8 тыс/мкл. Однако пик лейкоцитоза приходился у животных этой группы на"40 день до 11,90*0,39 тыс/мкл против 8,52*0,9 тыс/мкл в контроле.
Значительные изменения отмечены нац^ и при изучении лейкофор-мулы крови у подопытных животных по сравнении с контролем. У животных наблюдали эдзинофчлию, которая была наиболее выражена к концу опыта. На протяжении всего периода исследований отмечалось незначительное увеличение количества нейтрофилов.".
2.2.4.3. Кинртика абсолютного количества Т- лимфоцитов
В течение первых 15 дней мы наблюдали снижение Т- лимфоцитов с 2580*29,4 до 1330*21,2 Е-Р*Ж/мкл с последующим подъемом на 30 день до 5922^57,3 Е-РОК/мкл, однако на 40 день количество Е-РОК снизилось и было ьыше, чем-у животных контрольной группы. Следует отметить, что в ходе исследований существенных изменений качественных показателей Ь-РОК у контрольных овец мы не.отмечали, и они соста&дяхи от 138Э±26,0 до 3520-10,2 Е-РОК/мкл. »
2.2.4.4. Кинетика тесфиллинчувствительных и теофиллинрезистснтных Т~ лимфоцитов
Через 5 дней о начала ошта установлено снижение количества Тфр-РОК/мкл при незначительном увеличении Тфч-РОК.
Изучение способности Тт лтафоцитов" к розетаообразованию в, присутствии теофиллина, проведенное на 10-15 дни с начала опыта, показало, что в эти дни достоверно снижалось как количество Тфр-РОК, так и-количество Тфч-РОК. Однако, с 20 дня наблюдаюсь резкое увеличение Тфр-РОК у животных подопытной и контрольной 1рупп. Изучение розеткообразующей способности Тфч-РОК в крови овец на 40 день с начала эксперимента позволяет говорить о количественном-взлете числа теофиллинчувствительных Т- лимфоцитов у опытных животных с одновременным снижением Щ>р-Р0К /2137*268,"3 Тфч-РОК - 2320*110,2 Тфр-РОК/ против 2266^532,3 Тфр-РОК - 846*378,7 Тфч-РОК в контроле.
При изучении иммунобиологической реактивности овец в опыте определяли индексные показатели: соотношение числа теофиллинрезис-тентных Т- лимфоцитов к теофиллинчувствительным Т- лимфоцитам. Индексные показатели снижались у подопытных животных на 5, 10, 30 и 40 дни исследований. Предел доверительного интервала, отражающий сбалансированность Т- клеточной система, приходился только на 5-10 дни после заражения.
2.2.4.5. Кинетика абсолютного количества В- лимфоцитов
ири изучении функциональной активности В-лимфоцитов в реакции розеткообразования установлено, что на 5 день после заражения:ки-вотных количество ЕАС-Р0К резко увеличелось до х276^25,8 ЕАС-РОК/мкл против 708-27,4 ЕАС-РОК/мкл в контроле. В последующие дни исследований констатировали снижение В-лзш|оцитов до 96±22,6 ЕАС-РО^мкл. При исследовании крови на.-20 день с начала опыта установлено достоверно, по сравнению-с контролем /1-221^10,4 ЕАС-РОК/жп/, повышение ЕАС-Р0К в крови подопытных животных. Последугщее изучение розеткообразующей способности В-лимфоцитов у опытных животных выявило статистически значимые изменения количества ЕАС-Р0К как у подопытных, так и контрольных овец, которые выражались в снижении их количества.
2.2.4.6. Результаты акарологических исследований
На 10 день исследований у 4-х овец из пяти мы находили живых накожниковых клещей, а начиная с 15 дня у всех подопытных животных были обнаружены клещи, причем их количество в течение всего ошта
шстоянно увеличивалось.
Таким образом, результаты проведенных нами исследований показали, что заражение овец клещами ovi<3 вызывает изменения в их иммунном статусе. Угнетение Т~зависимого иммунного ответа и неспецифической активности Т-лимфоцитов свидетельствует об угнетающем воздействии клещей на Т-систему иммунитета хозяина. Полученные данные подтверждается и повышением сулрессорпой активности Т-лим-фоцитов.
Исследования по изучению индекса иммунорэгуляции показали, что заражение животных накожндковыми клещами сопровождается изменением ИИ, указывающего на дисбаланс в системе Т-лтфоцитов.
В связи с тем, что до наших исследований отсутствовали какие-либо сведения о воздействии накожниковых клещей на иммунную систему овец, было решено полученные нами данные /1992г./ перепроверить путем повторного проведения исследований в аналогичном эксперименте 1993 г. /2.2.4.7. - 2.2.4.12./.
2.2.4.7. Клинические наблюдения. Изменения в ^клиническом статусе подопытных и контрольных ОЕец аналогичны первому опыту.
2.2.4.8. Кинетика общего количества лейкоцитов. Анализ подсчета количества лейкоцитов в крови овец подопытной группы показал до- . стоверное, по отношению к контролю, увеличение их количества уже
на 5 день поело первого заражения до 8260*6,60 тыс/мкл, с последующие повышением лейкоцитов до 9330^30,1 тыс/мкл на 10 день. "У кдвот-"шх коктроланой группы количество лейкоцитов в эти дни составляло 6690*83,2 - 5ЭС0*13",3 тыс/мкл. Следует отметить, что лейкоцитоз у подопытных животных был на протяжении всего периода исследований и лишь к 40 дню мы регистрировали снижение общего количества лейкоцитов до 7370*51,7 тыс/мкл, однако оно было выше, чем у контрольных животных.
При изучении лейкоцитарной формулы крови овец подопытной и контрольной групп обращает на себя внимание эозинофилия: уже на 5 день мы отмечапи повышение эозинофилов до 3,3*1,0$ против 2,5*1,0 в контроле. Повышенное количество эозинофилов констатировали на 10 и 15 дни исследования до 4,0*0,8? против 1,2*0,2 - 1,0*0,7$ в контроле.
Проведенный до начала исследований подсчет нейтрофилов и моноцитов не выявил статистически значимой разници у жигзтных подопытной. и контрольной групп.
Полученные результаты подтверждают, что экспериментальное заражение животных клещами Ts. ovls вызывает изменения в лейкоформуле /эозинофилию/.
2.2.4.9. Кинетика абсолютного количества Т-лимфоцитов. Полученные данные в отношении Т-снстеш иммунитета и динамики Т-клеток при псороптозе свидетельствуют об активация и угнетении Т-клеточного звена на разных стадиях развития болезни. Так, на 5. сутки с начала эксперимента нами зарегистрировано незначительное увеличение Е-РОК до 2880*17,2 ¿-РОК/мкл. Однако, уже на 10 день количество Т-лимфо-цитов увеличилось в 1,6 раза, что выражалось в количественном отношении в 4210*77,2 Е-РОК/мкл против 2061*36,7 Е-РОК/мкл в контроле.
Последующее изучений розеткообразукщей способности -Т-лимфоцитов крови подопытных животных выявили статистически значимее увеличение Т-лимфоцитов до 2959*39,7 Е-РОК/мкл, которое было зарегистрировано нами на 30 день с начала эксперимента, и снижение их количества на 40 сутки.
2.2.4.10. Кинетика теофиллкпчувствитольных и тбофиллинрезистен» тных Т-лимфоцитов. Через 5 суток с начала опыта установлено снижение Тфр-РОК в крови подопытных овец до 522-11,2 Тфр-РОК/мкл, при одновременном резком увеличении 1фч-Р0К у этих же животных; на 15 и 30 дни
с начала опыта до 3779±10,6- 2363*26,1 Тфр РОКАисл, пру контрольном уровне 2254±26,5-1594^31,2!фр -РОК/мкл, с незначительным снижением их количества на 20 и 40"дни.
2.2.4.11. Кинетика абсолютного количества Б-лимфоцитов. в крови овец через 5 суток после заражения выявлено снижение количества В-ли-мфоцитов до 506±63,0 ВАС-РОК/мкл. Однако, уже на 10 день мы отмечали резкое увеличение количественных показателей, рецепторной активности В~лим£оцитоь до 965*21,5 ЕАС-РОК/мкл; у контрсльных"животных их было 578*88,0 ЕАС-РОК/мкл.
Изучение функциональной активности Б-лим|оцитоь в реакции розет-кообразования показало дальнейший подъем В-лимфоцитов вплоть до 30 дня после первого заражения со снижением к концу исследований.
2.2.4.12. Результаты акарологических исследований. Живых клещей Рэ.мы находили /на 10 день/ после первой подсадки у о животных из 5, а на 15 и в последующем до 40 дня их количество увеличивалось.
Таким образом, прг. заражении животных какожниксвыми клещами, в начале болезни идет увеличение ка.к Т-, так и В-лимфоцитов, которое" затем сменяется резким снижением Т-лимфоцитов на 20-40 дни и увеличением В-лимфоЦитов дс 30 дня.
Нами также установлено, что экспериментальное заражение животных клещамиЪ.очи вызывает снижение хелперной функции Т-системы на 5 и 20 дни исследования и активацию Т-супрессороЕ до конца исследований.
2.2.5. Изучение акарицадной эффективности препаратов при псороптозе овед
2.2-5.1. Остаточное акарицидное действие ивомека и его пролонгированных форм. Исследования по выявлению продолжительности остаточного акарицидного действия серийного ивомека производства Мерк Шарп и Домье /США/ и его"пролонгированных форм /ИК-1, ИК-2, ИК-3, ИП-1/, любезно представленных Институтом иммунологии Минздрава Российской Федерации, были выполнены в виварии Ставропольской НИЗС на овцах кавказской породы в гозрасте 10-12 месяцев в зимне-весенний период 1990-1991 гг. Для опытов было подобрано 30 овец /25 свободных от псо~ роптоза и 5 больных/. Диагноз подтвержден акарологически. Животных разделили на 6 групп /по 5 голов/ и забирковали.
Свец первой группы обработали серийным ивомеком подкожно в под-ло"ктевую складку в дозе 200 мкг/кг по д.в. Овцам второй, третьей и четвертой групп ввели соответственно препараты. ИК-1, Ж-2, ИП-1 в дозе 0,02 -мл/кг массы тела; овцам пятой группы также в подлоигевую складку, подкожно ввели препарат ИК-3 в дозе 0,03 мл/кг. Пролонгиро-1 ванные формы изомека и серийный ивомек вводили однократно. Овец, больных псороптозом /группа И 6/, обработке не подвергали., они служили источником инвазии. Животных всех шести групп поместили в одно помещение (где они находилась в постоянном контакте между собой.
В результате исследований было установлено, что животные первой группы, обработанные однократно ивомеком, заболели через 30 дней после начата эксперимента, овцы второй, третьей и пятой групп - через 23 дня, а"овцы четвертой группы, заболели через 36 дней. У заболевших овец появились первичные очаги поражения в области боков туловища, на спине и крестце. При клиническом осмотре на коже в местах поражения были видны папулы и везикулы, а во взятых соскобах находили на-кожниковых клещей.
Следовательно, при однократном применении ивомека остаточное акарицидное действие его составило не более 8-10 дней, препаратов- ИК-1, ИК-2 и ИК-3 - 3-5 дней, а у препарата ИП-1 - 13-15 дней.
Учитывая результаты проведенного экспериментамы сочли целесообразным сравнить остаточное акарицидное действие препарата ИП-1 и импортного ивомека при двукратном их применении. В опыт было взято 15,овец 2-х летнего возраста /10 свободных от дсороптоза и 5 .больных/. Овец разбили на 3 группы /по 5 в каждой/.- Овцам.первой группы ввели ивомек в дозе 1 мл на 50 кг массы тела, подкожно в подаюктевуа складку, двукратно с интервалом 7 дней. Овцам второй группы ввели
Щ-1 в дозе 0,02 мл на кг живой массы тела, также в подлоктевую складку, двукратно с интервалом 7 дней. Овец третьей группы, больных псороптозом, лечению не подвергали /контроль/. Подопытных и контрольных животных содержали в одном помещении, за ними проводили тслиничес-кие наблюдения и акарологические исследования.
Установлено, что овцы первой-группы, обработанные ивомеком, заболели на 47 день после введения препарата, а животные второй группы", обработанные препаратом ИП-1,- заболели через 57 дней. У овец появились незначительные очаги в области плеча и подгрудка. При клиническом осмотре и исследовании соскобов, взятых из очагов поражения, найдены живые и парализованные клещи ТЧого^е? оисх. У животных контрольной группы пеороптоз принял генерализованную форму.
Анализ полученных результатов показывает, что ьзомек при двукратном применении профилакткрует овец против заражения псоролозом в течение 24-26 дней; остаточное акарицидное действие препарата Щ-1 /также при двукратном применении/ составило 35-36 дней.
2.2.5.2. Акарицидная эффективность клеевой формы ивоыека. Клеевую форму ивомека нам предоставил Всероссийски]! научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники /ВНИИИМТ/.
Опыт проведен в весенний период на 15 спонтанно зараженных на-кожниковыми клещами овцематках 4-х летнего возраста. Животных раздел» ли на подопытную /10/ и контрольную /5 овец/ группы. Овец подопытной группы обработали препаратом подкожно в локтевую складку, однократно в дозе 0,3 мл на "50 кг массы тела. Контрольных овец лечению не подвергали и содержали раздельно.
Результаты систематически проводимых клинических обследований и микроскопии соскобов кожи свидетельствуют о высокой терапевтической эффективности данного препарата при псороптозе овец. Случаев рецедиво заболевает.. в.течение двух месяцев /срок наблюдения/ не отмечали;
Остаточное акарицидное действие клеевой формы ивомека определяли в опыте на 15 овцах, которых разделили на 3 группы: в первой и второй - овцы свободные от псороптоза, овцы третьей - сольные псороптозом /взяты из неблагополучной отары/. ""
Животных первой группы /й=5/ обработали клеевой формой, ивомека подкожно, однократно" в дозе 0,3 мл на 50 кг массы тела; овец второй групгш /й=5/ обработали серийным ивомеком производства Мерк Шарп и Домье, подкожно, однократно в подлоктевую складку в дозе.1 мл на 50 кг массы тела; третья группа /й=5/ лечению не подвергалась /контроль/ Овец 1-й, 2-й" и 3-й групп содержали в одном помещении, где они находились в постоянном контакте между собой. Кроме того, после введения
препаратов животным 1-й и груш непосредственно на кожу были под- сажены клещиРъ. во всех фазах развития. Учет результатов испы-
тания препаратов проводили путем клинического наблюдения за животными и акарологических исследований соскобов кожи.
Результаты проведенных исследований показали, что остаточное акарицидное действие клеевой формы ивомека с учетом инкубационного периода составило £0-23 дня, а серийного ивомека, также с учетом этого периода, всего 5-6 дней. Следовательно, однократное применение* клеевой Формы ивомека по персистентности соответствует двукратному применению серийного препарата "Ивомек".
2.2.5.3. Акарицидная эффективность ивомека пурон. Пурон - 0,5% раствор ивермектина на изопропилоеом спирте /фирмы МСД США/, рекомендован для обработки крупного рогатого скота методом поливания.
Эксперимент поставили на 10 овцах 4-х летнего возраста, спонтанно зараженных псороптозом. Животных разделили на 2 аналогичные группы по 5.голов в каждой. Первую группу обработали ивомеком пурон в дозе 1 мл на 10 кг массы тела, методом поливания, однократно на кожу спины /предварительно раздвинув штапель/ с помощью дозатора, входящего в комплект упаковки препарата. Вторую группу овец не лечили /контроль/. При наблюдении за подопытными овцами после обработки случаев токсикоза отмечено не било. Содержание овец подопытных и контрольных групп било раздельным.
При обследовании подопытных овец через 12, 19, 26, 32, 39 дней и дза месяца,рецидивов болезни не отмечали, что свидетельствует о высокой лечебной эффективности препарата и возможности применения его для борьбы с псороптозом овец.
2.2.5.4. Акарицидная эффективность препарата $ 41. Препарат.№41 нагл любезно предоставили сотрудники Всероссийского института гельминтологии имени Скрябина /БИГИС/..
В опыте было 15 овцематок из неблагополучной по псороптозу отару. Диагноз подтвержден акарологически.
Животным первой группы /й=5/ ввели препарат в дозе 2 мл, овцам второй группы /й=5/ - 3 мл на 50 кг массы тела, подкожно в подлокте-вую складку. Овец первой и второй групп содержали вместе, третью группу пе лечили /контроль/ и содержали отдельно.
Наблюдение за животными и их обследование проводили з течение 20 дней. Улучшения клинического состояния у ов.ец за. этот период не наступало; болезнь прогрессировала, также как и у овец контрольной группы.
2.2.5.5. Акарицидная эффективность аверсекта. Новый отечественный акарицид аверсект /аналог ивомека/ был предложен НПО "Фармбиомед" и Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии /ВНИИВСГиЭ/.
Опыт проведен на 20 овцах, пораженных псороптозом.
Овец разделили на 4 группы по 5 голов в каждой. Овцам первой группы ввели подкожно аверсект в дозе 1,5 мл на 50 кг живой массы в подлоктевую складку, однократно. Овцам второй группы - аверсект в той же дозе, но двукратно, с интервалом в 10 дней. Овцам третьей группы - ивомек в дозе 1 мл на 50 кг массы тела, двукратно," с интервалом 10 дней. Овцы четвертой группы служили контролем. Животных всех груш содержали раздельно в прикошарно-базовом режиме.
Учет результатов терапевтической эффективности препаратов проводили путем клинических наблюдений за"животными и исследований соско-Оов кожи через 1, 2, 3, 6, 10, 17, 23, 30, 37, 43, 50, 66 дней после обработки. "
Анализ результатов акарологйческих исследований и клинических наблюдений с 6-го по 66 день показал, что животные подопытных групп были клинически здоровы. У животных контрольной группы отмечали усиление развития болезненного процесса.
Остаточное акариг.идное действие аверсекта при псороптозе овец. С целью выяснения вопроса оо остаточном акарицидном действии аверсекта при псороптозе овец проведен опыт яа 15 овцах /10 - свободных от лсороптоза к 5 болышх/, которых разделили на 3 группы /по 5 гол./.
Овнам первой группы подкожно ввели аверсект одно?д?атно, в подлоктевую складку в дозе 1,5 мл на 50 кг массы ачла. Овец второй группы обработали серийным", ив оме ком полкото, двукратно с интервалом в 7 дней, по мл на 50 кг массы тела. Овец третьей группы не обрабатывал^ они служили контролем лечебной эффективности препаратов и источником инвазии при совместном содержании с овцами подопытных групп
Учет результатов опыта и оценку остаточного акарицидного дей-лаш испытуемы- препаратов устанавливали по результатам клинического обследования животных и микроскопического исследования соокобов кожи с промежутками в 5-7 дней до начала псороптогного процесса у животных первой & второй групп.
Данные проведенных исследований, которые продолжались до клинического проявления болезни у овец подопытных групп, ползали, что аверсект /серия от 24.08.92/, примененный однократно в дозе 1,5 т. на 50 кг массы животного, обеспечивает остаточное акарицидное действие на протяжении 40-44 дней, а изомек на 22-24 дня.
2.2.5.6. Акар.гцидная эффективность препаратов■ И-1, И-2. Препараты И-1, И-2, полученные из Института иммунологии Минздрава Российской Федерации, содержат в качестве д.в. ивермектин и вспомогательные вещества,"усиливающие, по мнению авторов, акариционое действие
и стабильность препаративной формы.
Для проведения опыта из неблагополучной по псороптозу отары были 0T06pe_i. больные овцематки в количестве 39; диагноз подтвержден акарологически. Из них сформировали 3 группы. Овец первой группы /13 голов/ обработали препаратом И-1 подкожно в подлокгевую складку, однократно в дозе 1 мл на 50 кг массы тела. Овец второй подопытной груипы /16 голов/ обработали препаратом И-2 подкожно, однократно и в той же дозе, что и первая" группа. Овцы третье«! группы /10 голов/ лечению ив подвергались, служили контролем, Зйнзотных подопытных и контрольной групп содержали раздельно в прикошарно-базово<л режиме.
На 5-7 сутки после инъекций препаратов у овец в соскобах обнаруживали только мертвых клещей. Наблюдения и исследования продолжались в течение ЗБ дней. Животные были излечены от псороптоза, случаев рецидивов заболевания не выявлено.
2.2.5.7. Акарицидная эффективность саркопцвдина. Саркопцидин -акарвдидннй препарат микробиологического синтеза, изготовлен на основе культуры актиномицета St^eplowyees sp штамм № 15, предоставлен Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной энтомологии и арахнологии /ВНЖВйА/.
Акарицидность саркопцвдина изучали на 14 овцематках с выраженными клиническими признаками псороптоза. Овец разделили на две группы и содержали раздельно.
Одну группу животных /9 голов/ обработали 2%-пой водной суспензией препарата путем втирания в пораженные участки кожи, двукратно с интервалом в 7 дней; вторую группу овец /контроль - 5 голов/ обработали водопроводной водой, на которой готовили суспензию саркопци-дина. В среднем ча каждую овцу израсходовали от 100 до 150 ш суспензии саркопцидина. Как после первой, так и после второй обработки признаков- токсикоза л видимых отклонений от физиологической нормы у овец не отмечали. В соскобах кожи в течение 7 дней обнаруживали живых и единицы мертвых накожников. После повторной обработки и до окончания опыта /2 месяца/ живых клещэй h. oi/i-s не обнаруживали.
У контрольных животных в течение этого сррКа болезнь прогрессировала.
2.2.5.8. Производственные испытания. Результаты исследований
по изучению акарицидных свойств препаратов показали, что в числе испытанных наибольшей эффективностью, по сравнению с импортным ивомеком, обладают клеевая форма ивомека, саркопцидин, аверсект к препарат ИП-1. Это позволяет нам рекомендовать их для производственных испытаний. Однако, из-за отсутствия достаточных количеств, нам удалось испытать в проивводстве только аверсект и клеевую форму ивомека.
Испытание клеевой Форш ивомека. В ОПХ "Темнолесский" обработали отару овец кавказской породы в количестве 280 голов, в которой 45-50? животных имели "клинические признаки псороптоза /облысение, свисание руна в области предплечий, туловища и корня хвоста, -расчесы/. Диагноз был подтвержден акарологически. "
„ Учет эффективности проводили через каждые 6-10 дней после введения препарата в течение двух месяцев. Окончательный учет результатов-терапевтического действия клеевой форш ивомека был получен по итогам прошедшей зимовки.
Установлено, что после однократного подкожного применения клеевой формы ивомека /0,3 мл на 50 кг массы тела животного/, достигнут высокий терапевтический ■эффект /ЭЭ=100#/. Случаев рецидивов заболевания в отаре не было на протяжении всего стойлового периода.
Испытание аверсекта. Опыт провели в ОПХ "Темнолесский" на" отаре /700 голов/ овец, пораженных ггсороптозом. Диагноз подтвержден акарологически. После подкожного применения аверсекта обследование овец проводили через 1СК15 дней в течение двух месяцев. Установлено, что препарат /серия от 24.08.92/, примененный однократно в дозе 1,5 мл на 50 кг массы животногоявляется эффективным при псороптозе. У овец на 4-5 де?^ после инъекции аверсекта прекратился зуд, псороптозные очаги очистились от струпьев и корок на 20-30 дни и начали обрастать новой шерстью.
По результатам проведенного опыта можно сделать вывод, что терапевтическая эффективность аверсект? была достигнута после однократного его применения /срок наблюдения - 61 день/.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Анализ результатов исследований по оценке Т- и В-лкмфоцитов показал, что в механизме иммунного ответа при эксперимент-дьном псоропто: участвуют как клеточные, так и гуморальные механизмы иммунитета. При этом следует отметить, что уже в первые дни болезни включаются как Т-, так ж В-лимфоциты. Однако, при расшифровке динамики Т-лимфоцитов на субклеточном уровне, то есть при определении Т-хелперов /теофиллш резистентные лимфоциты / и Т-супрвссоров /теофиллинчувствительные
лимфоциты/, ь первые дни болезни мы не отмечали резкого дисбаланса в отношении Т-лимфоцитов, несущих регулятсрнне функции, что указывает на отсутствие глубоких иммунологических нарушений в звене Т-кле-точной регуляции.
Не имея литературных данных по изучаемому вопросу, нам хотелось высказать предположение, что характер выявленных сдвигов показателей иммунологического гомеостаза носит защитный характер, так как наблюдается активация, защитных реакций в виде изменения функционального состояния рецепторного аппарата. Иммунологические реакции включаются еще в начальной стадии болезни и связаны с развитием патологического процесса не только в коже, но и во всем организме овец. Считаем, что исследования в этом направлении необходимо продолжить.
Изыскание и испытание акарицидных препаратов биологического синтеза показало перспективность широкого применения клеевой формы ивомека, аверсекта, саркопцидина, препаратов ИП-1, И-1 и И-2, как более эффективных и экологически безопасных для борьбы с псороптозом овец.
1. Характер и выраженность иылунного ответа у овец, больных псороптозом," определяется циклом развития накожниковых клещей.
В иммунный ответ вовлечены как клеточные-, так и гуморальные механизмы. -
2. При экспериментальном псороптозе установлена активация Т-лимфоцитов в ранний период болезни с последующей супрессией, обусловленной нарушением количественного состава их рёгулятерных субпо-луляцш.
3. Гуморальный иммунный ответ при псороптозе характеризуется активацией В-лимфоцитов с 20 по 40 день /предел наблюдений/ после заражения накожниковыми клещами.
4. "Высокоэффективным акарицидным действием при псороптозе овец обладают: аверсект - 1,5 мл на 50 кг массы животного при однократном подкожном применении; сатаошидия - мзтодом двукратного орошения или втирания в пораженные участки кожи 2%-ной водной суспензии; клеевая форма ивомека - 0,3 мл на 50 кг массы животного -при однократном подкожном применении; ИП-1. К-1. И-2 - 1 мл на 50 кг "массы животного, подкожно, однократно; ивомек пурон - 1 мл на 10 кг массы тела животного, методом поливания вдоль позвоночного столба.
5. Препараты ИК-1, ИК-2, Ж-3 и № 41, обладая слабой акарицвд-1 ностью, не обеспечивают ни лечебной, ни профилактической эффективности противопсороптозной обработки овец.
Практические предложения
Результаты наших исследований вошли в следующие нормативные документы:
1. Временное наставление по применении биологического акарици-да саркопцидин для лечения сельскохозяйственных животных и пушных зверей при саркоптоидозах. Утверждено Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 22.10.1990 г.
2. Временное наставление по применению аверсекта при лсоропто-зе крупного рогатого скота и овец."Утверждено Главьым управлением ветеринарии МСХ РФ 11 декабря 1992 г.
1. Вишняков Г.В., ЭДективность саркопцидина при псороптозе овец // Ветеринария. - 1993. - № 5. - С. 35.
2. Вишняков Г.В., Иммунобнологическая реактивность овец при псороптозе // Доклада Российской академии сельскохозяйственных наук. - 1993. - № 3. - С. 69-72.
3. Ремез В.И., Жаров В.Г., Башкатэв Г.А., Прохорова З.Г., Вишняков Г.В. Профилактика и меры борьбы с основными арахдо-энто-мозами от зц в Ставропольском крае // Рекомендации. - Ставрополе, 1990.. - 21 с. .
4. Вишняков Г.В., Водянов A.A., Акарицидная эффективность аверсекта при псороптозе овец. - Сб. науч. тр. / Ставрои. СХИ. -Ставрополь, 1994. - С. 13-14.
/57 I.-"CCokj /7*
Субпопуляции: Т-клетки хелперы (Th 0, Th 1, Th 2, Th 17), CD 4+ регуляторные Т- клетки (Treg, Tr 1, Th 3), CD 4+ CD 25+ Fox. P 3+ цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ), CD 8+
Недостатки биологических методов: ◦ Трудоемкие и сложные в исполнении; ◦ Требуют значительно больше времени до получения конечного результата, а также особых стерильных условий и оборудования для постановки; ◦ Менее специфичные, чем иммунохимические методы. Преимущества: Отличаются достаточно высокой чувствительностью; С биологической точки зрения являются более правильными, поскольку измеряют только биологически активные формы цитокинов. Все методы оценки биологической активности цитокинов in vitro могут быть объединены в 5 основных групп: Биологические методы
Методы оценки биологической активности цитокинов; Иммунохимические методы; Молекулярно-биологические методы. Изучение системы цитокинов проводится на различных уровнях в зависимости от конкретных задач и включает следующие основные подходы: Генетический анализ на предмет отсутствия мутаций в генах цитокинов, их рецепторов и белков внутриклеточных сигнальных систем запуска синтеза и передачи сигнала; Анализ полиморфизма генов цитокинов; Изучение экспрессии генов цитокинов; Изучение уровня продукции цитокинов клетками в культуре; Определение концентраций цитокинов в биологических жидкостях; Изучение синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток; Изучение синтеза цитокинов в тканях. Методы оценки функционирования системы цитокинов
Анализ на уровне клеток-продуцентов (мононуклеарные клетки, лимфоциты, лейкоциты, макрофаги, ДК и др.) Генный уровень - Исследование генов, которые ответственны за синтез цитокинов и их полиморфизмов, методами, основанными на ПЦР. - Идентификация адаптерных и других молекул, которые проводят сигнал, запускающий транскрипцию цитокиновых генов (ПЦР, иммуноблоттинг и др.). Клеточный уровень - Выявление и определение количества клеток (Тh 1, Th 2, регуляторные Т- лимфоциты), содержащих цитокины (методом внутриклеточного окрашивания цитокинов). - Подсчет количества клеток, секретирующих анализируемые цитокины (методом ELISPOT). Анализ растворимых цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма - Количественное определение цитокинов с помощью ИФА. - Тестирование биологической активности цитокинов на различных моделях (клеточные линии, клетки-мишени и др.). - Иммуногистохимическое окрашивание цитокинов в тканях. - Определение соотношения оппозитных цитокинов (например, про- и противовоспалительных), а также цитокинов и их антагонистов. Определение действия цитокинов на клетки-мишени - Выявление экспрессии рецепторов цитокинов и их генов (проточная цитофлюориметрия, ПЦР). - Анализ молекул, участвующих в передаче сигнала с рецепторов цитокинов в клетках-мишенях (ПЦР, иммуноблоттинг). - Анализ фенотипа и функциональной активности клеток-мишеней после действия на них конкретного цитокина (проточная цитофлюорометрия, методы биологического тестирования) Комплексный анализ системы цитокинов включает несколько последовательных этапов
◦ Оценка пролиферативной активности клеток (стимуляция или подавление); ◦ Оценка цитотоксичности; ◦ Определение экспрессии мембранных рецепторов, синтеза других цитокинов и т. п. ◦ Оценка влияния на функциональную активность клеток (что всегда зависит от типа клеток и от изучаемого цитокина, например оценка хемотаксиса либо оценка завершенности фагоцитоза); ◦ Оценка противоинфекционного действия, как в случае интерферона. 1. Биологические методы
ИЛ 1 определяется в культуре моноцитов, стимулированных ЛПС Используются мыши инбредной линии C 3 H/He. J Тимоциты этих мышей стимулированы митогенами (конканавалин А=Кон. А, фитогемагглютинин=ФГА) и отвечают на ИЛ 2 и митогены Метод: последовательные 2 Х разведения суспензии тимоцитов в специальной среде и контрольных образцов; разведения переносят в 96 -луночные планшеты и инкубируют; затем вносят метку в культуру клеток и счетчиком определяют включение метки КС = M ср(образец)/Мср(контроль), Мср – среднее число имульсов в трех лунках Если КС 3, ИЛ 1 активен (с большой достоверностью) Определение биологической активности ИЛ 1
Используемые клетки: клетки-фибробласты эмбрионов кур и человека, перевиваемые клетки диплоидных фибробластов человека, культура клеток L-929 Используемые вирусы: вирус энцефаломиелита мышей (ВЭМ), вирус везикулярного стоматита мыши Методика: культуру клеток в среде вносят в 96 - луночные планшеты и инкубируют для образования монослоя; далее проводят титрование исследуемых образцов путем 2 Х разведений на монослое; к образцам + ВЭМ и инкубируют их Уровень активности ИФН определяется по обратному значению максимального разведения образца Определение биологической активности ИФН
Для ИЛ-2 используют мышиную клеточную линия HT 2. ИЛ-2 определяют по способности: 1) поддерживать рост Т-лимфобластов, стимулированных митогеном 2) поддерживать длительный рост зависимой линии Т-клеток в культуре CTLL (линия цитотоксических Т-лимфоцитов) ИЛ-4 может усиливать синтез ДНК в В-клетках, стимулированных к пролиферации антителами к Ig. M. Биоанализ для определения И-2 и ИЛ-4.
Цитотоксический индекс: ЦИ = {(a b) a} 100% (a – количество живых клеток в контроле, b - количество живых клеток в опыте) В данном методе используются 2 контроля: ØПоложительный – рекомбинантный ФНО ØОтрицательный – клетки в культуральной среде Условная активность ФНО – значение обратного разведения образца, необходимого для получения 50% клеточной цитотоксичности Определение биологической активности ФНО
Методики количественного определения концентрации растворимых цитокинов в различных биологических жидкостях: Иммуноферментный анализ в различных модификациях (ИФА) Радиоиммунный анализ (РИА) Мультифакторный анализ Для анализа экспрессии цитокинов и их рецепторов на мембранах клеток, а также продукции цитокинов клетками в культуре и в тканях: 1. Цитофлюориметрические методы – для анализа экспрессии поверхностных молекул клеток (мембранных форм цитокинов и рецепторов цитокинов) и определения цитокинов в цитоплазме клеток. 2. Метод оценки продукции цитокинов – единичными клетками в культуре (ELISPOT). 3. Иммуноцитохимия и иммуногистохимия – для оценки содержания цитокинов в цитоплазме клеток на мазках и на срезах тканей. 2. Иммунохимические методы
Большинство иммуноферментных тест-систем адаптированы для работы с любыми биологическими жидкостями. Для измерения уровней цитокинов на системном уровне используют сыворотку или плазму крови. сыворотку крови Обычно их концентрации находятся на пределе чувствительности иммуноферментного метода; более целесообразно измерять их уровни в интересующих исследователя тканях или в биологических жидкостях (слезная жидкость, жидкость десневых карманов, смывы из полостей, моча, спинно-мозговая жидкость). жидкость Иммунохимические методы
Уровень жидкости Тетраметилбензидин Стрептавидин-пероксидаза Вторые антитела, конъюгированные с биотином Цитокин Лунка планшета Оценка секреции ИФН г методом ELISPOT
Принцип работы большинства современных тест-систем заключатся в использовании «сэндвич» -варианта твердофазного иммуноферментного анализа. Высоко специфичны; Быстры (время постановки ИФА составляет менее 5 ч) Относительно просты в исполнении; Порог чувствительности достигает 0, 5 пкг/мл.
Метод РИА сходен с ИФА, но используются меченные радиоактивные изотопы. Чувствительность РИА достаточно высока, но в последнее время метод применяется редко. Для оценки уровня цитокинов используется также другая модификация стандартного ИФА с применением флюоресценции. Вместо цветного субстрата берется субстрат фермента пероксидазы, меняющий под действием фермента флюоресценцию(например, люминол). Радиоиммунный анализ.
Преимущества метода: Одновременный анализ до 100 цитокинов в одном образце Многократное уменьшение объема исследуемого образца Увеличение воспроизводимости результатов Экономия времени, снижение стоимости исследования и трудозатрат Мультифакторный анализ
Мультифакторный анализ Иммуноанализ типа «сэндвич» , в котором антитело связанно с поверхностью микрочастицы (микрошарики, микрочипы) Сходный принцип с ИФА Микрочастицы различного размера (диаметр 4, 4 и 5, 5 мкм) Отдельные виды микрочастиц можно идентифицировать по отличающейся интенсивности флюоресценции и размеру
Принцип метода: ◦ Первые антитела сорбированы на микрошариках; вторые антитела могут быть помечены разными флюорохромами или другими метками, что позволяет проводить измерение уровней сразу нескольких цитокинов; ◦ Далее принцип реакции похож на стандартный ИФА в планшетах Вторые антитела, меченные флюоресцеином цитокин Первые антитела микрошарик Мультифакторный анализ
Методика определения синтеза цитокинов изолированными клетками: (0, 6 мл) Свежая венозная кровь, взятая в емкость с гепарином – тщательно перемешивают и разводят в 5 раз средой RPMI 1640 (2, 4 мл) – добавляют 2 м. М глутамина и 80 мкг/мл гентамицина. В качестве индуктора синтеза группы провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF), IL-10, IFN- и хемокинов могут быть использованы препараты ЛПС в концентрации 1 -10 мкг/мл. В качестве индукторов синтеза IL-2, IL-4, IFN-γ и других Т- клеточных цитокинов может служить ФГА (50 мкг/мл). 1. индуктор 2. разведенная кровь 37 о. С, 5%СО 2 исследование содержания отбор супернатанта цитокинов в биологическом 24 ч или иммуноферментном тесте У больных подсчитывают количество лейкоцитов и формулу крови по стандартным методикам. Полученные данные пересчитывают на 1 млн лейкоцитов либо мононуклеаров, лимфоцитов или других интересующих клеток в 1 мл крови(с учетом разведений). 3. Определение продукции цитокинов клетками
Определение рецепторов и мембранных форм цитокинов Определение внутриклеточных цитокинов ◦ Блокирование клеточного метаболизма ◦ Фиксация клеток ◦ Пермебиализация клеточной мембраны (используется сапонин в сочетании с блокаторами обратного транспорта (брефелдин А или монензин) для предотвращения экскреции антител из цитоплазмы клеток). Изучение продукции цитокинов клетками методом проточной цитометрии
Может дать дополнительную информацию о состоянии местного иммунитета Иммуногистохимические методы с использованием специфических поликлональных или моноклональных антител к цитокинам Цитокины могут быть обнаружены в цитоплазме клеток в мазках клеточных суспензий; кусочки тканей обычно глубоко замораживают, а затем готовят срезы толщиной 4 -6 мкм в криостате(- 20 о. С) 4. Определение уровней цитокинов в тканях
Метод непрямой иммуногистохимии: ◦ Изучение локализации цитокинов в клетках; с использованием специфических антител к цитокинам ◦ На втором этапе используют антивидовые антитела, меченные флюорохромами (для люминесцентной микроскопии), (возможно выявление как цитоплазматических цитокинов, так и их мембранных форм) или ферментами (для световой микроскопии) В случае ферментов используют биотинилированные антивидовые АТ, а на последнем этапе – стрептавидин-пероксидаза либо стрептавидин-щелочная фосфатаза. Определение уровней цитокинов в тканях
Определение экспрессии генов цитокинов по накоплению м. РНК; Специфические олигонуклеотидные зонды (от нескольких нуклеотидов до целой к. ДНК, соответствующей гену искомого цитокина) При использовании метода гибридизации in situ на свежих криосрезах тканей или мазках клеток для выявления локализации м. РНК цитокинов могут использоваться комплементарные РНК-зонды для РНК- гибридизации. 5. Молекулярно-биологические методы изучения цитокинов
При использовании метода гибридизации in situ на свежих криосрезах тканей или мазках клеток для выявления локализации м. РНК цитокинов могут использоваться комплементарные РНК-зонды для РНК-гибридизаци. метод позволяет определять количество и тип клеток наличие м. РНК необязательно отражает присутствие цитокина в клетке, необходима комбинация методов, позволяющих оценитьи эксперссию м. РНК и синтез данного цитокина Гибридизация in situ для выявления клеток, содержащих м. РНК ИЛ-1β, среди мононуклеаров крови человека
RT-PCR(обратная транскрипция); real-time PCR; Методы microarray (позоляют анализировать одновременно несколько сотен генов) Использование аптамеров Молекулярно-биологические методы изучения цитокинов
Аптамеры - олигонуклеотиды, полученные по технологии SELEX. Используют для количественной оценки уровня цитокинов, в том числе в модификации ИФА, где вместо антител в качестве распознающих цитокины молекул используются аптамеры
Изменение соотношения клеток, продуцирующих различные цитокины, может отражать патогенез заболевания и служить критерием прогноза заболевания и оценки проводимой терапии. Методом внутриклеточного окрашивания определяют экспрессию цитокина на уровне одной клетки. Проточная цитофлуориметрия позволяет подсчитать количество клеток, экспрессирующих тот или иной цитокин. 6. Внутриклеточное окрашивание
Имеются некоторые ограничения: ü с их помощью невозможно анализировать синтез цитокинов единичной клеткой, üневозможно определить количество цитокинпродуцирующих клеток в субпопуляции, üневозможно определить, экспрессируют ли цитокинпродуцирующие клетки уникальные маркеры, üсинтезируются ли различные цитокины разными клетками или одними и теми же.
Врожденные нарушения регуляции Цитокин-зависимый ПИД: наследственный дефект гена гамма цепи рецептора ИЛ-2(делеция АКО 62, 81) Х- сцепленный ТКИД (характеризуется отсутствиемпадением содержания Тлф и резким снижением показателей клеточного и гуморального иммунитета) Дефицит альфа субъединицы ИЛ-7 ТКИД(снижение кол-ва Тлф, но нормальные показатели Влф, НК) Нарушения в системе ИЛ-12, 23, ИФНг и их R повышенная восприимчивость к инфекциям, вызываемых микобактериями и сальмонеллами, Listeria monocytogenes. 7. Роль цитокинов в патогенезе заболеваний
SNP(single nucleotide polymorphism)-важный диагностический маркер, который определяется МБМ, т. к. не удаляется ЕО и сохраняется в популяции. Ген ФНО: замены -308(Г А) и -238(Г А) в нетранслируемой области в зоне промоторных участков. Приводит к увеличению продукции ФНО в 2 -5 раз. В 4 раза чаще встречается у больных с тяжело протекающей церебральной формой малярии, в 7 -8 раз у больных с развившимися тяжелыми нарушениями НС Функциональный полиморфизм генов цтк
Ревматоидный артрит-поражение синовиальной оболочки, хрящевой и костной ткани суставов. У больных с РА в синовиальной оболочке обнаружены плазмоцитоидные и миелоидные ДК, МФ, которые синтезируют широкий спектр цтк, способных индуцировать дифференцировку наивных Тлф. Ключевой медиатор- ФНО и ИЛ 1. ФНО вызывает функциональную активацию синовиальных фибробластов, эндотелаильных клеток и привлечение Лц, синтез цтк, воспаление и ремоделирование ткани сустава. Вмешивается в метаболизм липидов, вызывая кахексию. Ил-6 стимулирует синтез острофазных белков в печени. Роль в развитии аутоиммунной патологии
У больных в ПК выше число клонов Тлф, синтезирующих ИЛ-3, 4, 5, 6, ФНО. Бронхиальная астма- ИЛ 4, 5, 13(Тх2) Обнаружение в пуповинной крови ИФНг, связано с низким риском развития БА. Определение уровня и продукции цтк у детей раннего возраста может быть важным эдементом диагностики для выявления предрасположенности к аллергии. Цтк и аллергия
Цтк служат важными мишенями иммунодиагностики многих заболеваний. Изучение уровня цтк позволяет получить информацию о функциональной активности различных иммунокомпетентных клеток, тяжести воспаления, его переходе на системный уровень и прогнозе, соотношении процессов активации Тх. Оценка функционирования цтк позволяет по- новому подойти к изучению состояния ИС организма в клинической практике. Заключение